Dünya çapýnda hepatit C virus(HCV) enfeksiyonu önemli bir halk saðlýðý sorunudur. HCV 11 farklý protein ürünü oluþturan yaklaþýk 3011 aa’lik tek bir poliproteini kodlar. Bu poli proteinin proteazlar tarafýndan kesilerek iþlemlenmesi sonucunda oluþan NS3(non-structural protein 3) proteini, serin proteaz ve NTPaz/helikaz iþlevlerine sahip 631aa’lik en büyük proteinlerinden biridir. HCV NS3 proteininin hücre içi yolaklarýn inhibisyonuna katýlmasý ve immun sistemden kaçýþta oynadýðý rol ile ilgili veriler yetersizdir.
Bu çalýþmada Türkiye’de yerel bir HCV kökenine ait NS3 proteininin saflaþtýrýlarak sitokin yanýtý çalýþmalarýnda kullanýlabilirliðinin gösterilmesi amaçlanmýþtýr. Bunun için Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi Merkez Laboratuvarý’ndan tanýsal araþtýrma amacýyla HCV genotip 1b taþýdýðý bilinen hastadan izole edilen HCV RNA kalýp olarak kullanýlmýþtýr. HCV-RNA’nýn NS3 kodlayan bölgesi RT-PZT ile çoðaltýlarak bir ekspresyon vektörü aracýlýðý ile klonlanmýþ ve tam uzunlukta HCV NS3 proteini Escherichia coli M15 hücrelerinde eksprese edilmiþtir. Ekspresyon vektörü olarak 6x His-tag dizisi içeren pQE30 plazmiti kullanýlmýþtýr. Rekombinant protein nikel–nitrilotriasetik asit(Ni–NTA) agaroz afinite kromatografisi ile denatüre edici þartlarda saflaþtýrýlmýþtýr. Sitokin yanýtý çalýþmalarý için saðlýklý 4 erkek ve 3 kadýndan oluþan grubunun tam kan ve periferik kan mononükleer hücreleri rekombinant NS3 ile uyarýlmýþtýr. Uyarýlan hücrelerin ve kontrollerin bulunduðu ortam süpernatanlarýnda IFNγ, IL-4, IL-10 sitokin yanýtlarý kantitatif ELISA yöntemi ile deðerlendirilmiþtir. Rekombinant NS3 proteinine karþý uyarým sonrasý yanýtlar deðerlendirildiðinde özellikle uyarýlan tam kan örneklerinde belirgin bir IL-10 yanýtý ortaya çýktýðý gözlenirken IFNγ ve IL-4 için ayný durum gözlenmemiþtir. Sonuç olarak ülkemizden bir HCV genotip 1b kökenine ait NS3 proteini saflaþtýrýlmýþ olup sitokin yanýtlarý ile ilgili optimizasyon ve standardizasyon açýsýndan daha geniþ çalýþmalar gerekmektedir.
Anahtar Kelimeler: HCV, rekombinant NS3 protein, IL-10, ELISA, SDS-PAGE, Nested PCR
|
