Dünya çapında hepatit C virus(HCV) enfeksiyonu önemli bir halk sağlığı sorunudur. HCV 11 farklı protein ürünü oluşturan yaklaşık 3011 aa’lik tek bir poliproteini kodlar. Bu poli proteinin proteazlar tarafından kesilerek işlemlenmesi sonucunda oluşan NS3(non-structural protein 3) proteini, serin proteaz ve NTPaz/helikaz işlevlerine sahip 631aa’lik en büyük proteinlerinden biridir. HCV NS3 proteininin hücre içi yolakların inhibisyonuna katılması ve immun sistemden kaçışta oynadığı rol ile ilgili veriler yetersizdir.
Bu çalışmada Türkiye’de yerel bir HCV kökenine ait NS3 proteininin saflaştırılarak sitokin yanıtı çalışmalarında kullanılabilirliğinin gösterilmesi amaçlanmıştır. Bunun için Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi Merkez Laboratuvarı’ndan tanısal araştırma amacıyla HCV genotip 1b taşıdığı bilinen hastadan izole edilen HCV RNA kalıp olarak kullanılmıştır. HCV-RNA’nın NS3 kodlayan bölgesi RT-PZT ile çoğaltılarak bir ekspresyon vektörü aracılığı ile klonlanmış ve tam uzunlukta HCV NS3 proteini Escherichia coli M15 hücrelerinde eksprese edilmiştir. Ekspresyon vektörü olarak 6x His-tag dizisi içeren pQE30 plazmiti kullanılmıştır. Rekombinant protein nikel–nitrilotriasetik asit(Ni–NTA) agaroz afinite kromatografisi ile denatüre edici şartlarda saflaştırılmıştır. Sitokin yanıtı çalışmaları için sağlıklı 4 erkek ve 3 kadından oluşan grubunun tam kan ve periferik kan mononükleer hücreleri rekombinant NS3 ile uyarılmıştır. Uyarılan hücrelerin ve kontrollerin bulunduğu ortam süpernatanlarında IFNγ, IL-4, IL-10 sitokin yanıtları kantitatif ELISA yöntemi ile değerlendirilmiştir. Rekombinant NS3 proteinine karşı uyarım sonrası yanıtlar değerlendirildiğinde özellikle uyarılan tam kan örneklerinde belirgin bir IL-10 yanıtı ortaya çıktığı gözlenirken IFNγ ve IL-4 için aynı durum gözlenmemiştir. Sonuç olarak ülkemizden bir HCV genotip 1b kökenine ait NS3 proteini saflaştırılmış olup sitokin yanıtları ile ilgili optimizasyon ve standardizasyon açısından daha geniş çalışmalar gerekmektedir.
Anahtar Kelimeler: HCV, rekombinant NS3 protein, IL-10, ELISA, SDS-PAGE, Nested PCR
|
